得克萨斯理工大学保罗·L·福斯特医学院医学教育系，美国德克萨斯州埃尔帕索市，邮编79905
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Int. J. Mol. Sci. 2023, 24(1), 829; https://doi.org/10.3390/ijms24010829
Submission received: 2022年11月21日 / Revised: 2022年12月23日 / Accepted: 2022年12月30日 / Published: 2023年1月3日
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药物结合物已成为肿瘤治疗靶向药物领域的重要研究焦点。肽-药物结合物（PDCs）是药物结合物的一个子集，由载体肽（长度在5到30个氨基酸残基之间）、毒性药物载体和连接物组成，连接物将药物载体与肽连接起来。PDCs进一步分为细胞穿透肽（CPPs）和细胞靶向肽（CTPs），它们在传递细胞毒性药物载体方面各有不同。一般而言，与其他药物结合物（如抗体-药物结合物（ADCs））相比，PDCs在肿瘤穿透、合成和成本便捷性以及减少非靶向效应方面具有优势。此外，与传统的癌症治疗（如化疗和放疗）相比，PDCs对目标癌症的特异性更高，在较小剂量下通常具有较少的毒副作用。然而，PDCs可能存在一些缺点，如稳定性差、由于其较小的尺寸而导致快速肾脏清除以及由于其肽结构的消化而限制口服生物利用度。通过改进可以克服其中一些挑战，尽管存在缺点，但PDCs固有的小尺寸和高目标特异性仍使其成为肿瘤治疗研究中具有吸引力的领域。
癌症是全球死亡的重要原因，其中乳腺癌和肺癌在女性中的患病率最高，而肺癌和前列腺癌在男性中的患病率最高。根据世界卫生组织（WHO）的数据，其他主要癌症包括结肠直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌和食管癌。癌症在美国的少数族裔社区中存在不均等现象。此外，WHO估计全球有897万人死于癌症，使癌症成为全球第二大死因，仅次于心血管疾病。癌症的财务影响也很严重，据估计，2013年美国个人医疗支出约为1555亿美元。
在历史上，癌症的一线治疗是手术切除原发肿瘤。20世纪，放射治疗和化疗药物如氨甲喋啶、阿霉素和顺铂开始问世。然而，传统的化疗和放疗广泛作用于快速分裂的细胞，包括非癌细胞，如毛囊或肠上皮细胞。尽管是标准治疗，这些方法不加区分地作用于癌细胞和非癌细胞的快速增殖细胞，这就解释了与传统化疗或放疗治疗相关的副作用，如脱发和胃肠不适。尽管在肿瘤药理学方面取得了进展，如免疫疗法，但非靶细胞毒性仍然是一个主要关注点，努力通过增加新的化疗药物的靶向特异性来减轻这些影响。
减少这些副作用的一种方法是开发直接靶向感兴趣细胞的治疗药物；这在21世纪首次通过单克隆抗体靶向癌细胞中过表达或突变的特定抗原而实现。针对癌症的更为选择性的靶向方法已经发展，例如使用与抗体连接的化疗药物将治疗输送至癌细胞。这些药物被称为抗体-药物结合物（ADCs）。尽管相比标准化疗药物，ADCs具有诸多优势，但也存在一些缺点，包括抗体聚集、ADC过早解离、高速药物清除率、肿瘤穿透效果不佳以及旁观者效应导致的靶外细胞毒性6，7。为了克服ADCs的一些限制，开发了更小的癌症靶向化疗药物，采用肽链机制，称为肽药物结合物（PDCs）。与ADCs类似，PDCs由3部分构成：（1）肽载体，（2）细胞毒性荷载，以及（3）连接物8。总体而言，肽载体促进肿瘤靶向，荷载（治疗药物）促进抗癌生物效应，连接物将肽载体与荷载连接起来（图1）。
PDCs和ADCs之间的主要区别通常在于（1）免疫原性，（2）渗透性和（3）清除。
免疫原性：在本综述的背景下，免疫原性可定义为药物或分子由于机体识别注入的药物为外源物质而引发免疫反应的不良能力。一般认为PDC具有低免疫原性特征，因为肽具有低固有免疫原性[9]。另一方面，ADC可能比PDC具有更高的免疫原性风险。这是由于ADC中的各种结构域，如抗原表位、连接剂和细胞毒性药物，可能导致抗药抗体（ADAs）的产生[10]。ADAs可能会使药物失活，导致疗效和靶向性降低，总体暴露不足[10]。
渗透性：PDC分子的重量较小（~2–20 kDa），使得PDC能够渗透肿瘤基质并进入肿瘤细胞9。相比之下，ADCs具有较大的分子量（~160 kDa），导致其在固体肿瘤细胞表面的传输受限10。Chalouni和Doll进行的一项研究中，利用流式细胞术确定了基于抗CD30 mAb的ADC的内化速率。结果表明，20小时后，表面结合的cAC10抗体的初始水平仍保持60%11。
消除：PDCs通常具有较短的半衰期，并且被肾脏迅速排泄9。此外，由于其体积较小，PDCs能够到达大分子如ADCs无法到达的肿瘤部位。ADCs的半衰期比PDCs长，且被肝脏非特异性摄取，可能导致对肝脏的剂量限制毒性10。
PDCs的策略和创新利用小分子肽的生物活性和潜力来提高治疗的效果。由于药物或输送载体与细胞之间的第一个相互作用点是外表面，癌组织中任何异常表达的受体都提供了靶向输送的焦点。肿瘤细胞通常具有独特肽序列的受体。由于药物或输送载体与细胞之间的第一个相互作用点是外表面，癌组织中任何异常表达的受体都提供了靶向输送的焦点。
已经有多种尝试合成PDCs用于癌症治疗。2018年，177Lu-DOTA-TATE（DOTA-TATE）（图2）获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，被认为是首个PDC类药物。DOTA-TATE用于治疗生长抑素受体阳性的胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-NETs）[16]。总的来说，这样可以使足够的药物输送到癌症部位，同时最大限度地减少与健康组织的接触。在这里，我们详细介绍了PDC领域最新进展，包括当前临床试验的总结以及PDC在精准医学时代面临的挑战。
尽管ADC已在临床上被确立为癌症治疗方法，但PDC作为一种新的癌症治疗方法正逐渐获得认可，通过增加靶向药物传递，提高疗效并减少副作用。与其他市售抗癌药物（如ADC）相比，PDC采用更小的分子组成，有助于提高PDC的生化稳定性、细胞膜穿透能力和整体疗效。PDC可以进行改良以优化结合亲和力和理化性质，确保正确的结合和裂解。PDC被归类为细胞穿膜肽（CPPs）或细胞靶向肽（CTPs）。
定向靶向特定器官被认为是限制传统抗癌治疗副作用的关键步骤。利用肽来实现器官特异性靶向已被视为一种明显可能性。目前有两种主要方法来靶向肽，1) 依赖于自然蛋白序列，如血管内皮生长因子（VEGF）18或生长抑素19。或者可以通过噬菌体展示技术测试肽库20。然而，这些技术通常会产生可以靶向肿瘤微环境但对特定器官定向性较差的肽。同样，某些器官比其他器官更容易被靶向，例如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）可用于轻松靶向肺腺癌21，22。然而，一些器官在存在强大的物理屏障时更难被有效靶向，比如胰腺癌以强大的成纤维细胞增生为特征，在肿瘤细胞周围形成机械屏障23，或者是需要穿越血脑屏障（BBB）的脑癌。尽管如此，正在进行开发以利用噬菌体衍生的穿梭肽，这些肽可以选择反对BBB内吞机制，并用于工程新型PDCs以治疗脑癌24。
细胞膜提供了生理屏障，限制了各种分子（如大分子、蛋白质和核酸）跨越细胞膜的运输。然而，细胞膜也可以限制药物的渗透。因此，开发能够穿过癌细胞细胞膜的药物以诱导破坏是至关重要的。
细胞穿透肽（CPPs）可以利用特定的氨基酸序列（范围从5到30个残基）穿越细胞膜，运送药物负载。CPPs为将细胞不透性化合物或药物运送到其细胞内靶点提供了有效方法。关于CPPs如何穿透细胞，已提出了各种作用机制。两种普遍接受的机制是（1）直接穿透细胞膜和（2）内吞作用。直接穿透发生在带正电的CPPs与带负电的膜组分相互作用时，破坏膜并形成孔。此外，已观察到网格蛋白介导的内吞作用和巨噬细胞吞噬作用吸收CPPs。然而，需要开展更多研究以阐明细胞进入的确切机制。
由于细胞穿透肽（CPPs）能够进入大多数接触到的细胞，因此它们的治疗效果仅限于肿瘤内注射。然而，一些治疗方法已经发展出使用经过纳米颗粒修饰的CPPs通过静脉注射来靶向淋巴转移的治疗方法；胡等人的研究表明，将纳米颗粒与CPPs修饰后，抑制了肺癌肿瘤生长速率1.4倍，并显示出63.3%的淋巴转移抑制率。其他进展包括通过可激活的细胞穿透肽和可转导剂实现特异性肿瘤靶向。耦合屏蔽聚阴离子可创建可激活CPPs（ACPPs），该聚阴离子与具有特异性靶向可切割连接物的肽结合。例如，程等人的研究中，使用2,3-二甲基马来酸酐（DMA）的屏蔽基在生理pH下抑制CPP。然而，在肿瘤细胞外pH为6.8时，DMA被水解以激活CPP，将药物固定在癌细胞内。通过腹腔注射递送的可转导剂使用功能域来调节CPPs对不同组织的活性，以增加肿瘤的特异性。一个显著的例子是通过将缺氧诱导因子-1α与β-半乳糖苷酶融合来创建氧依赖降解（ODD）结构域，帮助其靶向缺氧肿瘤细胞。该结构域与HIV-TAT蛋白结合，以减少肿瘤生长，而不会引起通过递送活性caspase-3预期的毒性副作用。
细胞靶向肽（CTPs）长度为3-14个氨基酸，并利用在癌细胞表面过度表达的受体来靶向药物的传递。根据靶向受体的不同，CTPs可以导致药物在肿瘤周围局部积聚或在CTP结合后诱导内吞作用。CTPs与单克隆抗体（mAbs）具有类似特征，能够高亲和力地结合到它们各自的受体。然而，与mAbs不同的是，由于体积小，CTPs能更好地渗透肿瘤。
CTP的局限性包括依赖于特定受体的表达才能产生效果。诸如噬菌体展示等技术可以确定一种肽序列，该序列将特异性地结合癌细胞，并减轻先前提到的缺点。在Rasmussen等人的研究中，噬菌体展示被用于识别具有1000倍或更高结合效率和选择性的肽序列，特异性结合于人类结肠癌细胞。此外，环化和多聚化可以增加对选定受体的亲和力。环化将肽子迫使成为受限的环状构象，增加对蛋白酶和降解的抵抗力。多聚化将两个或更多单体连接在一起，以提高CTP的局部浓度，从而增加肽-受体相互作用的概率。CTP可以与CPP结合，更有效地将载体分子转运到癌细胞内。Bolhassani等人发现，将DNA烷化剂氯氨丁胺与CREKA（CTP）共轭到pVEC（CPP）（pVEC氨基酸序列LLIILRRRIRKQAHAHSK）的输送方式更适合运输，并导致比单独使用氯氨丁胺更高的癌细胞杀伤率。
PDC的连接区域将肽连接到药物，如图1所示。连接器在防止药物脱靶或外周释放并尽可能多地将药物传递至靶点（癌细胞）方面至关重要。连接器通过减弱药物活性并连接药物和肽来发挥作用。一旦PDC到达靶点，连接器被切断，药物以完全活性状态释放。连接器在循环中必须稳定，但在靶点处最好被切断，从而确保最大可能量的药物剂量到达靶点。多种类型的连接器利用不同的癌症或细胞内特征来实现这种优先药物释放。主要类别的连接器包括不可切割的、pH敏感的、酶敏感的和氧化还原敏感的。
以它们的名称来看，不可切割的连接剂似乎是矛盾的，因为连接剂的一个基本功能是在适当的时机被切割。然而，无论连接剂类型如何，都会有不可避免的裂解量在循环和间质中，导致药物过早释放和副作用35。不可切割的连接剂之所以得名，是因为它们相较于其他连接剂，更不容易在非靶位点被切割。药物通常在某些或所有连接剂仍附着在药物上的情况下制成活性状态35，36。这种抵抗切割的防御是由于不可切割的连接剂中连接肽和药物到连接剂的键的稳定性。正如177Lu-DOTA-TATE的化学结构所示(图2)，不可切割的连接剂通常由酰胺或酯键组成，这些键不太可能在细胞外断裂25，37。然而，即使稳定性更好，不可切割的连接剂也不像可切割的连接剂那样受欢迎36。
pH敏感基团中的连接剂通过比血浆和间质空间更酸的环境中会断裂的键将药物和肽连接到连接剂。最典型的pH敏感连接剂包含肼酮基团[36]（图4）。这些连接剂在循环中的血浆pH 7.4下是稳定的，但当暴露于肿瘤周围的pH为6.5-6.9或内部内体器官和溶酶体的pH分别为5.5-6.2和4.5-5.0的酸性环境时会断裂[35,36]。肿瘤由于增加的代谢需求产生酸性副产物而具有这种局部酸性pH[38]。
酶敏感连接剂将利用肿瘤或溶酶体内表达的特定酶的增加量[35]。这些连接剂可以包含酯和酰胺键，类似于不可切割的连接剂。然而，与酯/酰胺键仅含有碳键不同，酶敏感连接剂包括特定的氨基酸序列，允许酶靶向[35]，例如赖氨酸-瓜氨酸序列，被溶酶体半胱氨酸蛋白酶B所识别(图 4)。酯和酰胺键将被酯酶和蛋白酶/酰胺酶靶向，这些酶在肿瘤内和溶酶体内很常见。然而，可以根据癌症表达的酶来利用更具特异性的键[35]。
氧化还原敏感的连接剂利用细胞内抗氧化剂如谷胱甘肽，其细胞内浓度通常比血浆高1000倍（从细胞内的15毫摩尔到细胞外的15微摩尔）39。由于血流不畅导致局部缺氧条件促进了活性氧的增加产生，谷胱甘肽在肿瘤中的浓度甚至更高39，因此氧化还原敏感的连接剂通过二硫键与药物结合（图4），一旦进入细胞内，将被谷胱甘肽打破，但在细胞外稳定，因为那里谷胱甘肽的浓度明显较低。
与大多数癌症治疗一样，目标是针对癌细胞或肿瘤，并限制靶向外靶效应。PDCs 可以有选择性地作用于癌细胞；然而，它们传递的化疗药物战斧通常是熟悉的细胞毒性药剂。将传统化疗药物与肽结合的好处在于可以修改细胞毒性药剂的化学性质。例如，化疗药物的理化性质可以被改变，如溶解度、选择性和半衰期。肽结合可以用于许多分子，以创造新型 PDCs，将肽与已建立的化疗分子结合可能提高标准治疗的疗效。
通常，用于PDC的细胞毒性药物载体是传统的化疗药物，包括但不限于紫杉醇（PTX）、喜树碱（CPT）或阿霉素。细胞毒性药物通过各种作用机制在癌细胞中阻止有丝分裂或促进凋亡。紫杉醇是一种用于治疗转移性乳腺癌、肺癌、卵巢癌和食道癌的化疗药物，它结合微管并诱导凋亡。尽管紫杉醇相对有效，但它伴随着许多缺点，包括血液和神经毒性，以及可能引起过敏反应。此外，由于紫杉醇溶解度低，必须溶解在载体中，这只会增加引发过敏反应的可能性。然而，当与可切割二硫键连接物和八精氨酸肽结合时，无需载体即可显著增加溶解度。肽结合增加了紫杉醇的溶解度，而不会增加来自载体的过敏反应风险。阿霉素是一种常用的化疗药物，用于治疗多种癌症类型，包括肝癌、骨肉瘤和乳腺癌。阿霉素作为拓扑异构酶II抑制剂；然而，其理化性质使其极具挑战性，难以将细胞内阿霉素提高到治疗水平。将阿霉素改造成PDC可能会提高细胞内浓度，并通过防止肿瘤细胞将阿霉素运出癌细胞来降低相关的药物耐药性。
除了经典的化疗药物负荷外，PDCs还可以被利用来传递短干扰RNA（siRNA）到肿瘤细胞。一旦被CPP靶向，siRNA可以抑制翻译和随后的蛋白质合成。何等人采用这种方法针对胶质母细胞瘤，并发现肽共轭siRNA能够进入胶质母细胞瘤，而未共轭的siRNA无法进入，同时也能够沉默EGFR。
放射性核素是放射性同位素，可以发射粒子用于诊断或治疗。最初用于治疗多发性骨髓瘤的镥-177（177Lu）由于静脉注射方式、低剂量和能量较低的β−粒子而未能增加长期生存率。将177Lu与肽结合可使辐射充分照射到感兴趣部位的细胞，同时迅速清除非靶组织和器官中的放射性物质。例如，在第3期神经内分泌肿瘤治疗（NETTER-1）试验中，177Lu-DOTA-TATE与奥曲肽长效缓释剂相比，死亡风险估计降低了60%。
目前，有96项临床试验和1种FDA批准的PDC药物Lu-177 DOTA-TATE，所有这些试验都针对实体肿瘤中过度表达的抗原。PDC临床试验处于I期和II期，主要关注药物对有限数量患者的安全性和有效性。
第一个获得FDA批准的PDC是Lu-177 DOTA-TATE（Lutatera®）（图2）。Lu-177 DOTA-TATE是一种放射性标记的生长抑素类似物，于2018年获得FDA批准，作为治疗生长抑素受体阳性的胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-NETs）的首个类药物，并通过静脉注射（I.V.）给患者使用[16]。NETs是一种起源于全身内分泌组织的肿瘤。Lu-177 DOTA-TATE结合过度表达生长抑素受体2型的恶性细胞。一旦Lu-177 DOTA-TATE结合到其相应的靶点，Lu-177 DOTA-TATE会在肿瘤细胞内积累并释放细胞毒性辐射以杀死细胞[50]。最近通过冷冻电镜确定了生长抑素受体与生长抑素和奥曲肽（一种合成的长效环八肽生长抑素类似物）的复合物的三维结构（图5）[51]。这项工作为保守的配体四肽Phe-Trp-Lys-Thr（FWKT）序列作为受体结合的关键药效固定了结构基础。这个序列在几种天然生长抑素受体激动剂中都存在，包括生长抑素-14、生长抑素-28和皮质抑素-14，在奥曲肽和Lu-177 DOTA-TATE的化学结构中基本保留（图5）。
在 177Lu-DOTA-TATE 成功用于治疗成人生长抑素受体阳性 GEP-NET 并获得 FDA 批准后，我们的文章关注其他相关的正在积极招募临床试验的例子，这些试验利用 Lu-177 用于治疗各种癌症（表1）。我们确定了44项利用 Lu-177 作为 PDC 癌症治疗药物载体的临床试验。
尽管PDC具有许多优点，但在实施PDC疗法时存在一些限制。由于其低分子量，PDC表现出较差的稳定性，并且会经历快速的肾脏清除。这可能导致治疗效果有限，特别是对固体肿瘤。研究人员正在努力进行不同的肽化学和物理修饰，以克服这一挑战。一种修饰技术的例子是使用与PDC结合的金纳米颗粒（AuNPs）来增加它们的整体稳定性。Kalimuthu等人的研究表明，经过PEG包被的AuNPs测试后，可以确定它们是否能提供一个适合加载PDC的平台。他们的研究显示，与PEG包被的AuNPs结合的PDC在72小时预孵育后仍然活跃。相比之下，自由的PDC在24小时预孵育后没有细胞毒活性。另一种被广泛用作改善肽酶和化学稳定性的方法是使用环化技术。例如，肽稳定技术允许肽被锁定在所需的构象中，已被用于增强肽与其靶标的结合亲和力。
关于肾脏清除的另一个重要因素是肽序列的整体净电荷。增加肽序列的负电荷以延迟肾脏的肾小球滤过已被提出作为延长肽半衰期的方法。延迟肽的肾脏清除的其他方法包括增加肽的大小和流体动力学直径以及增加血浆蛋白结合以防止共轭物通过肾脏被过滤出去。一种策略是将聚乙二醇（PEG）与PDCs结合。PEG的固有特性使其成为理想的修饰候选者；它价格低廉，亲水性强，生物相容性好，且无免疫原性。与ADCs和其他更大分子（如蛋白质）相比，PDCs具有较低的免疫原性。然而，它们仍然可以从结构修饰中受益，以减少引发不良免疫反应的可能性。除了减缓肾脏清除外，聚乙二醇化还可以减少肽的免疫原性，尽管PEG本身存在免疫原性问题，对肽的生化修饰为PDCs的有益修饰开辟了另一条研究途径。