收到日期 2021 年 6 月 28 日；接受日期 2021 年 11 月 29 日。
版权 © 2021 胡、张、马、罗、潘、徐、江和王。
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背景: 染色体异常导致人类表型多样性和疾病易感性，但在临床中评估其致病效应很困难。因此，报告与正常表型或临床异常相关的染色体异常的新病例具有重要价值。
方法: 这是对携带21q21.1–q21.2异常的七个家系进行的回顾性分析。使用G-带和单核苷酸多态性阵列技术分析了胎儿及其家庭成员的染色体核型和拷贝数变异。
结果: 在七个家系中，所有胎儿及其家庭成员的核型均正常。在这里，发现六个胎儿携带母源性21q21.1–q21.2重复，范围从1到2.7 Mb不等，但没有母亲表现异常。在一个胎儿中发现了21q21.1–q21.2的8.7 Mb缺失。家系分析显示，这一缺失也在母亲、兄弟和外祖母中观察到，但未发现异常表型。
结论: 本研究在中国家系中发现了21q21.1–q21.2的异常。 21q21.1–q21.2重复携带者根据其表型没有临床后果，而21q21.1–q21.2缺失通过三代正常个体传递。 这为评估21q21.1–q21.2重复和缺失的致病性提供了良性临床证据，这在先前的报告中被认为是一种不确定意义的变异和可能的致病变异。
关键词: 21q21.1–21.2 复制, 21q21.1–21.2 缺失, SNP 阵列, NCAM2, 产前诊断
迄今为止，21q21的重复和缺失尚未包含在已知的致病综合征中。然而，上世纪80年代初，Park等人报告称，包括_NCAM2_基因在内的21号染色体部分三体型导致智力障碍，但不引起唐氏综合征（DS）的其他表型（Park et al., 1987）。Haldeman-Englert等人揭示了一名男孩，他因自闭症特征、显著言语延迟和社交互动不良而接受评估，携带了一个_de novo_ 8.8 Mb的21q21.1–q21.3缺失，涉及_NCAM2_基因（Haldeman-Englert et al., 2009）。此外，报道了三例神经发育障碍病例，临床表型异常包括全球发育迟缓、行为障碍和社交互动障碍。所有这些患者携带了涉及_NCAM2_的21q21.1–21.2缺失（Petit et al., 2015）。另一份病例报告揭示了一名患有自闭症谱系障碍和巨头的男孩携带了21q21.1–21.2的1.6 Mb缺失，其中包含_NCAM2_基因，但没有其他功能基因（Scholz et al., 2016）。此前，基于全基因组关联研究，_NCAM2_被提议为自闭症的候选基因（Hussman et al., 2011）。在智力障碍或自闭症患者中发现了_NCAM2_基因的重复、缺失和单核苷酸多态性，这些研究表明_NCAM2_可能在神经发育障碍中发挥作用。
在我们的研究中，六个家系中携带21q21.1–21.2重复的个体（其中一个家系的区域包含_NCAM2_）表现出正常表型。我们进一步发现了一个罕见的包含_NCAM2_ 的21q21.1–21.2 8.7 Mb 缺失，这一缺失通过三代正常个体传递。这些发现提供了良性证据，对于准确进行21q21.1–21.2异常的产前诊断遗传咨询至关重要。
自2016年1月至2020年12月进行了一项回顾性研究。共有7例患者携带21q21.1–21.2缺失或重复，这些患者是从11,867名怀孕妇女中筛选出来的，她们有相关指征（如异常的无创产前检测（NIPT）或胎儿成像），并在西南医院产科产前诊断中心进行了羊水穿刺或脐带穿刺等侵入性诊断检测。在检测之前，已从父母处获得侵入性产前诊断的知情同意。该研究已获得第三军医大学西南医院伦理委员会（陆军军医大学）的批准。从6个不相关的中国家庭中确定了6个携带21q21.1–q21.2重复的胎儿，因为已收集到了他们的家系验证信息，分别标记为家系1、2、3、4、5和6。此外，一个携带21q21.1–q21.2缺失的胎儿及其家庭成员被标记为家系7。这7个家系的孕妇没有怀孕并发病史，并否认有任何相关家族史。
家谱1-6：羊水穿刺时母亲年龄在25至32岁之间，孕周在18+2至25周之间。家谱3中的孕妇选择进行羊水穿刺，是因为超声检查显示胎儿有肺分叶。其他人选择进行羊水穿刺，是因为无创产前筛查显示染色体21异常。
Pedigree 7: 一名22岁的女性（孕4，产1）在孕26+5周时接受了脐带穿刺术，因为胎儿的双侧脑室扩大，经超声检查测试（左侧：14mm，右侧：14mm）。
每个外周血样本约0.5 ml，每个脐带血样本约0.4 ml 接种到T细胞培养基（BAIDI, 中国）中，在37°C下孵育3天。每个羊水样本约20 ml 接种到羊水培养基（BIO-AMF™-2, BI, 中国）中，在37°C、5% CO2条件下孵育7-10天。根据标准方案，采用G带染色技术进行染色体核型分析，羊水样本分辨率为400条带，血样本为550条带，并根据2016年国际人类细胞遗传学命名体系（ISCN 2016）标准描述核型，参考文献为Stevens-Kroef et al., 2017。
未培养的羊膜液样本（每胎10 ml），脐带血样本（每胎600 µL），以及家系成员的外周血样本（每人600 µL）被收集，使用天智基因组DNA提取试剂盒（中国天智，中国）提取DNA。Infinium全球筛查芯片组（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）包含大约700,000个全基因组标记SNP。基因组DNA与Infinium全球筛查芯片组杂交，如先前报道的那样（Srebniak等，2011）。芯片组使用iScan芯片扫描系统（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行扫描。使用GenomeStudio V2011.1软件（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行分子核型分析，用于注释。大于100 kb或影响超过50个标记的拷贝数变异（CNVs）被考虑，并基于GRCh37（hg19）基因组进行注释。根据指南（Richards等，2015; Riggs等，2020），科学文献和公开数据库进行CNVs评估，包括DGV（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home），OMIM（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），gnomAD（http://gnomad-sg.org/），DECIPHER（http://decipher.sanger.ac.uk），dbVar（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar），ClinVar（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar），ClinGene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen/），以及Pubmed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）。良性或可能良性的CNVs未报告。
怀孕第二和第三季度的超声检查结果已收集。出生后6个月至3年间，通过电话进行了产后临床随访评估。在获得父母的知情同意后，收集了儿童的医疗数据以评估发育细节。根据世界卫生组织0-3岁婴儿的身体和心理发育表，专业医生进行了一般儿童医疗。三级医院的儿童医疗根据《丹佛发育筛查测试》进行（Wijedasa, 2012）。
羊水样本、脐带血样本和家庭成员的外周血样本进行常规核型分析，因为平衡重排会逃脱SNP阵列检测（Levy and Wapner, 2018）。
谱系1-6：常规的G带分析显示胎儿和其父母的核型正常。
系谱 7：尽管常规的 G 带染色体分析可能能够描绘大于 5-10 Mb 大小的染色体异常（Shaffer and Bejjani, 2004），但我们的研究未能发现 21q21.1-21.2 的 8.7 Mb 缺失。由于染色体 21 的尺寸较小，缺失区域只能在 700 带分辨率以上被识别，而传统的羊水细胞核型分析最多只能达到 550 带分辨率。因此，胎儿（III:2，图 1），其哥哥（III:1，图 1），母亲（II:2，图 1）和外祖母（I:2，图 1）均具有正常的核型。其父亲（II:1，图 1）和外祖父（I:1，图 1）也具有正常的核型。
系谱1–6：六个无关系谱的胎儿携带了21q21.1–q21.2的重复，这些重复是从母亲那里遗传而来的，坐标和长度与母亲的相同。最小的重复长度为1 Mb（chr21:20,195,657–21,199,532，hg19版本），最大的为2.7 Mb（chr21:23,573,580–26,310,725，hg19版本）。系谱1、2、3、5和6中的重复区域不包含任何蛋白编码基因，只有系谱4中的重复包含 NCAM2 基因（表1；图2；补充图S1）。所有父亲也进行了SNP阵列检测，结果为阴性。
七个家系胎儿的染色体异常。
家谱
位置（hg19）
大小（Mb）
异常类型
核型
蛋白编码基因内容
继承
谱系 1
chr21: 20,195,657–21,199,532
1
复制
46,XY
—
垫
谱系 2
chr21:23,573,580–24,697,989
1.1
复制
46,XX
—
垫
谱系 3
chr21: 23,288,789–25,106,099
1.8
重复
46,XY
—
垫
谱系 4
chr21: 22,734,409–25,148,429
2.4
重复
46,XX
NCAM2
垫
谱5
chr21:23,272,300–25,104,945
1.8
重复
46,XX
—
垫
谱系 6
chr21: 23,573,580–26,310,725
2.7
复制
46,XY
—
垫
谱系 7
chr21: 16,767,983–25,441,375
8.7
删除
46,XY
BTG3, C21orf91, CHODL, CXADR, NCAM2, TMPRSS15, USP25
垫
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8724545/figure/F2/
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21q21.1–q21.2的拷贝数变异（蓝色表示重复，红色表示缺失）。家系1-7来自我们的病例；#256222、#331844、#276325、#327587、#289444、#289445、#254181和#274603记录在Decipher中；nsv995050、nsv531520和nsv534303记录在dbVar中；nsv4279387和nsv4532854记录在gnomAD中；dgv4402n100和nsv821690记录在DGV中。
Pedigree 7: SNP array results showed that the fetus (III:2, 图1) carried an 8.7 Mb deletion of chromosome 21q21.1–21.2 (chr21:16,767,983–25,441,375, hg19 build; 图2; 附图S1), and the pedigree analysis found that the CNV was inherited from the mother with a normal phenotype (II:2, 图1). To obtain more genetic evidence, the elder brother and maternal grandparents of the fetus were also tested with SNP arrays. The extended analysis of the pedigree revealed that two other healthy members also carried the deletion, the elder brother, 3 years of age (III:1, 图1), and maternal grandmother, 41 years of age (I:2, 图1). In addition, the results of others (II:1 and I:1, 图1) in this pedigree were normal. Otherwise, the elder brother was found to carry another deletion, which was located on 5p15.33 (chr5:19:38,139–1,124,703, hg19 build) and was proven to be a de novo variation of uncertain significance (VUS) mutation. No other significant CNVs were found among the seven pedigrees.
家系图1–6：怀孕的第二和第三孕期未发现异常，除了家系图3的胎儿有肺隔离。三名男孩（家系图1、3和6的胎儿）和三名女孩（家系图2、4和5的胎儿）足月分娩。目前，最年幼的个体为2.5岁，最年长的为3.5岁，根据儿童保健检查，他们都没有发育迟缓或智力障碍的迹象（表2）。
7个胎儿的临床随访评估。
胎儿
性别
出生时
与其他缺陷一起出生
常规儿童保健（6个月，12个月，24个月）
DDST的儿童保健
在学习
重量（千克）（%）
长度（厘米）（%）
18 m
24 m
年龄（m）
重量（千克）（%）
身高（厘米）（%）
1
男性
3.3 (46)
51 (72.2)
_
通过
NA
NA
42
15 (42.5)
102 (70.6)
2
女性
3.3 (56)
50 (67.7)
_
通过
通过
NA
41
15.5 (63.2)
101 (73.4)
3
男性
3.05 (26.8)
50 (52.4)
肺分叶
通过
NA
NA
41
14.5 (33.7)
98 (34.3)
4
女性
3.3 (56)
50 (67.7)
_
通过
NA
NA
37
14 (50.3)
95 (44.4)
5
女性
3.5 (71.6)
51 (83.9)
_
通过
NA
NA
33
14 (67.3)
93 (53.5)
6
男性
3 (23.3)
48 (15.9)
_
通过
NA
通过
32
14 (60.0)
94 (60.3)
7
男性
2.35 (1.1)
48 (15.9)
_
通过
NA
NA
8
8.5 (49.9)
70 (48.1)
Pedigree 7：孕32周时进行了超声和磁共振检查，两次检查均未观察到侧脑室进一步扩大（左侧：14mm，右侧：14mm，超声检查；左侧：12.5mm，右侧：13.6mm，磁共振检查）。经过遗传咨询，孕妇和丈夫选择继续怀孕。孕39周时，孕妇顺利分娩了一个健康男婴，没有特殊的面部特征。男婴目前8个月大，没有任何异常表型；此外，儿童的健康检查细节正常（表2）。他的哥哥已经3岁，也没有发育迟缓或智力障碍。
我们报告了携带家族性21q21.1–21.2异常的七个胎儿。家系1、2、3、4、5和6的胎儿都携带了母源遗传的21q21.1–q21.2重复，范围从1到2.7 Mb（表1）。关于该区域重复是良性还是致病的报道很少。在DGV、gnomAD、DECIPHER、dbVar和ClinVar等公共数据库中，发现了几个与我们病例部分重叠的21q21.1–q21.2重复的重要记录，并进行了分析（图2；表3）。在DGV（dgv4402n100）和gnomAD数据库（nsv4279387、nsv4532854）中仅记录了三个记录，但普通人群中拷贝数增加的频率尚未描述。此外，有一例智力障碍病例已被报道（DECIPHER，#256222），但没有关于其遗传和致病性分类的描述。另一例（DECIPHER，#331844）被描述为可能是良性变异，除了增加的颈部透明度外没有其他异常。在dbVar和CinVar数据库中发现了一个VUS变异（nsv995050），主要表现为发育迟缓。因此，在先前的报告中，该区域的重复被认为是VUS。我们研究中的21q21.1–q21.2重复仅包含一个蛋白编码基因_NCAM2_，预测不是三倍体敏感基因。金等人报告了一例胎儿及其母亲携带了包括_NCAM2_在内的21q21.1–q21.2 6.7 Mb重复，但表型正常。该区域明显大于我们病例的范围（位置从18,981,715到25,707,009）。该研究还为产前诊断中21q21.1–q21.2部分重复提供了良性临床证据（Jin等，2021）。基因内容的稀有性可能是使本研究中显示的这些CNV增益看似良性的主要因素。此外，位置效应是由基因组重排引起的CNV的分子机制之一，导致表型（张等，2009）。如果染色体重复不在原始位置而是转位到另一个染色体，其致病性是否会改变需要进一步研究。
患有21q21.1–q21.2异常的患者总结。
患者数据库
位置（hg19）
类型
大小（Mb）
蛋白编码基因
继承
致病性
表型
dbVar#nsv995050
chr21:21,601,231–22,573,421
复制
972 kb
NCAM2
未知
VUS
发育迟缓和/或其他重要的发育或形态表型
解密#256222
chr21:20,063,479–22,274,948
重复
2.2 Mb
—
从正常父母那里继承
'/'
智力障碍
解密#331844
chr21:22,782,651–24,339,651
复制
1.6 Mb
NCAM2
父亲传承
可能是良性的
增厚颈部透明带
解密#276325
chr21:22,434,634–26,315,434
删除
3.8 Mb
NCAM2
从受影响的母亲那里遗传而来
'/'
行为异常，言语和语言发展延迟
解密#327587
chr21:20,746,935–24,683,731
删除
3.9 Mb
NCAM2
未知
'/'
超重，反复性中耳炎，凉鞋间隙，口服葡萄糖耐量异常，棕色糠疹，全身性非运动（缺席）性癫痫发作，全身性发作性癫痫，简单性发热性癫痫发作，癫痫持续状态
解密#289444
chr21:21,044,211–25,051,262
删除
4.0 Mb
NCAM2
未知
VUS
异常的面部形状，身材矮小，智力障碍
解密#289445
chr21:21,044,211–25,051,262
删除
4.0 Mb
NCAM2
未知
VUS
智力障碍
dbVar#nsv531520
chr21:21,699,837–26,771,050
删除
5.1 Mb
NCAM2
母亲传承
致病的
骨骼系统异常，腭裂，全球发育迟缓
dbVar#nsv534303
chr21:16,714,035–24,198,636
删除
7.5 Mb
BTG3, C21orf91, CHODL, CXADR NCAM2, TMPRSS15, USP25
未知
致病性
口腔裂
解密#254181
chr21:16,992,255–24,898,237
删除
7.9 Mb
BTG3, C21orf91, CHODL, CXADR NCAM2, TMPRSS15, USP25
从轻度受影响的父亲那里继承而来
'/'
内眦赘皮、长而扁平的人中沟、高颚、低位耳朵、全球发育迟缓、行为障碍
解密#274603
chr21:17,451,703–25,948,154
删除
8.5 Mb
BTG3, C21orf91, CHODL, CXADR NCAM2, TMPRSS15
未知
'/'
杏仁形眼睛，肌张力低下和关节松弛，全球发育迟缓，社交互动受损
拷贝数增加和拷贝数减少的致病性在同一区域可能会有很大不同。在DGV数据库中发现了涉及_NCAM2_的拷贝数减少记录（nsv821690，图2），但在一般人群中的频率尚未描述。在公共数据库中发现了几例与我们病例高度重叠的21q21.1–21.2缺失相关的表型异常病例（图2；表3）。这些区域的大小约为4 Mb或更大。Petit等人提供了三例（Decipher#276325、Decipher#254181和Decipher#274603），详细描述了它们的遗传方式和表型（Petit et al., 2015）。在五例病例中（表3），缺失仅涉及_NCAM2_，患者表现出包括智力障碍、发育迟缓、异常面部形态和癫痫在内的异常表型。在两例病例（nsv531520和534303）中，一例被报告有骨骼系统异常、腭裂和全局发育迟缓，另一例有口裂。它们都被描述为致病性，其中只有一个CNV（nsv531520）是从母亲那里遗传而来的，但没有提供有关她表型的信息。总之，在先前的报告中，21q21.1–21.2缺失被确定为可能致病。然而，在我们的研究中，21q21.1–21.2缺失未发现与表型后果相关联。
先前和最近的研究揭示了_NCAM2_在神经发育中的重要作用（Sheng et al., 2019）。除了_NCAM2_，这一区域还有其他与临床表型相关的基因值得进一步分析。该区域包含七个蛋白编码基因，分别是_BTG3_、C21orf91、CHODL、CXADR、NCAM2、TMPRSS15_和_USP25。它们中没有一个被预测为半失能。除了_C21orf91_外，其他都是在线遗传性疾病（OMIM）基因。_BTG3_是生长抑制基因PC3/BTG/TOB家族的新成员（Yoshida et al., 1998），在各种人类组织中表达。在小鼠中的进一步分析显示，BTG3在发育中枢神经系统的脑室区高度表达。_C21orf91_被描述为在DS神经发生缺陷中发挥作用（Li et al., 2016），并在准确的寡脂质细胞分化中起重要作用，影响成熟能力和轴突髓鞘化（Reiche et al., 2021）。_CHODL_是一种1A型整膜蛋白，优先在骨骼肌、睾丸、大脑和肺中表达（Weng et al., 2003）。最近的研究表明，_CHODL_的缺失导致神经肌肉突触的解剖和功能缺陷（Oprişoreanu et al., 2019）。_CXADR_在大脑发育过程中表达水平增加，并被认为是自闭症患儿的候选基因（Iourov et al., 2010）。携带21q21.1微重复（从0.4到0.1 Mb）涉及_CXADR_基因的患者表现出发育迟缓和智力障碍等异常表型（Li et al., 2018）。_TMPRSS15_是一个致病基因，功能丧失变异导致肠激酶缺乏（Wang et al., 2020）。众所周知，_USP25_在中枢神经系统和外周神经系统中广泛表达（Bosch-Comas et al., 2006）。最近的研究表明，USP25在阿尔茨海默病和DS中的微胶质细胞稳态重编程中发挥关键作用（Zheng et al., 2021）。因此，BTG3、C21orf91、CXADR、_NCAM2_和_USP25_可能根据它们的假定或已知生物学功能参与表型。
异常不会产生临床表型的机制尚不清楚。由于已发表文献和公共数据库中对临床表型的有限或矛盾关联，该地区的遗传咨询变得具有挑战性。因此，我们的研究为基于产前诊断的21q21.1–21.2异常提供了良性证据，以便进行准确的遗传咨询。
我们感谢李蒙戴博士对文章和语法修改的建议。
涉及人类参与者的研究已经通过第三军医大学西南医院伦理委员会审查并获得批准（陆军军医大学）。编号为（B）KY2021023。参与本研究的被试者的法定监护人/近亲已提供书面知情同意。
HH 设计了研究并撰写了文章，RZ 进行了染色体分析，YM 进行了样本处理和数据分析，YL 进行了数据统计，YP 进行了后续工作，JX 进行了细胞培养，LJ 校对了论文并获取了资金，DW 进行了项目管理。
这项工作得到了中国国家自然科学基金资助（编号81971369，LJ）的支持。
作者声明，该研究在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
本文中所有观点仅代表作者自己的观点，不一定代表他们所属的组织，也不代表出版商、编辑和审稿人的观点。本文可能评估的任何产品或制造商可能提出的任何声明，出版商不作保证或认可。